Da li je visoki protok važniji od senzitivnosti?
Autoantitjela se više od pola stoljeća koriste kao biomarker kod sistemskih autoimunih bolesti (SAB) te predstavljaju osnovno stedstvo u dijagnostici oboljenja poput sistemskog lupusa eritematodesa (SLE), skleroderme, Sjőgrenovog sindroma.
U zadnje vrijeme, razvoj tehnologije kao i nerazumjevanje limitacija različitih metoda, dovelo je toga da se rezultati testova na antinuklearnna antitijela (ANA) neadekvatno koriste kao screening testovi za SAB.
Prema mišljenju eksperata, radi gore navedenih razloga, profesionalci koji rade u laboratorijama imaju odgovornost da poznaju finese njihovih metoda kao i da educiraju kliničare kako bi testiranja na ANA-a bila adekvatno korištena.
“ Mnogi ljekari opšte prakse ne poznaju dovoljno kriterije u dijagnostici autoimunih oboljenja kao i zamke koje se kriju kod ANA skrininga (screeninga). Postoji problem, veliki problem, lažnih klinički irelevntnih pozitivnih među zdravom populacijom. Navedeni problem je dobro prepoznat od strane reumatologa ali ljekari opšte prakse nisu svjesni ovog problema, “ prema riječima John L. Carey, MD, podpredsjednika odjela za patologiju i laboratorijsku medicinu pri Henry Ford Health System u Detroitu. “ To more pacijenata koji nemaju sistemsku autoimunu bolest, ali su pozitivni na testovima, kvare pozitivnu prediktivnu vrijednost ANA testa. Nažalost, ovaj problem nije prepoznat od strane kliničara i predstavlja pravi izazov za laboratoriju, na kojoj je da ispravi lažnu impresiju koju nameću klinički irelevantni pozitivni testovi.“
Za i protiv imunofuorescence
Kada je riječ o prenošenju znanja ljekarima o ANA testiranju, lažno pozitivni rezultati nisu jedini problem sa kojim se suočavaju laboratorije. I stare i nove tehnologije testiranja napreduju u svom razvoju, tako da su dostignuća koja bi mogli pomoći u poboljšanju specifičnosti do sada etabliranih metoda u porastu.
Indirektna imunofluorescenca (IIF) za detekciju ANA-a koristi se od 1950-ih. U početku su se kao supstrat koristili organi glodavaca a sada se najčešće koriste humane epiteloidne (HEP-2) stanične linije. IIF nudi prednosti pružajući ANA paterne, informacije o tiru, kao i detekciju više od 100 autoantitijela. Metoda ima vrlo visoku senzitivnot za određene SAB-i, kao što su SLE (85%), mješovitia bolest vezivnog tkiva (100%), lijekovima –indiciran lupus (100%).
Međutim, IIF ima i neke nedostatke. Ova Metoda je ne standardizirani manuelni test i ima subjektivnu interpretaciju rezultata te nisku reproducibilnost. Ova vremenski zahtjevna metoda sporog protoka, također ima udio lažno negativnih rezultata za određena autoantitijela, uključujući i Jo-1 (30%), ribosomal P (40%), antitijela na nukleuse antigena proliferirajućih stanica (30%). U bilo kojem trenutku, IIF može propustiti oko 15 posto lupus pacijenata, ali kad se već dijagnosticirani pacijenti se prate tijekom vremena, otprilike 97-98% imaju pozitivne rezultate IIF, prema Carey.
Sa druge strane, oko 13 % zdravih pojedinaca imati će poztitivan rezultat IIF za ANA pri razblaženju od 1:80. Iako se visoki titrovi sveukupno prihvataju kao klinički više signifikantni i indikativni na postojanje SAB-i, dokazi sugeriraju da se na pragu između 1:80 i 1:60, ANA titar „ ima mali uticaj na dijagnozu ili aktivnost bolesti“ prema Prof. Dr. Marvinu Fritzler, profesoru sa Universiteta Calgary u Alberti, Kanada.
Šta se nalazi u paternu?
Kada se desi da dobiju limitirane informacije proizašle iz titrova, kliničari tada za dijagnostičke zaključke koriste paterne. Nekoliko IIF paterna se dovodi u vezu sa specifičnim antigenima i SAB-om. Na primjer, patern mitotičkog aparata asociran je sa mitotičkim aparatom 1, koji je prisutan kod SLE-a i Sjőgrenovog sindroma. Međutim, paterni nisu uvijek povezani za specifični antigen ili bolest. Na primjer, tačkasti patren se dovodi u vezu se odgovarajućim antinuklearnim antitijelom poput SS-A/Ro, ali je također nađen u paternima drugih sistemskih autoimunih bolesti, kao i kod zdravih individua.
Iako postoje limitacije vezane za titar i paterne, neki naučnici ipak obraćaju pažnju na paterne i koriste ih da bi napravili razliku između zdravih individua i oboljekih od SAB-i. U nedavno izdatoj studiji, poredeći zdrave i pacijente sa SAB-ima, Brazilijanski istraživaći našli su razlike u patern profilima između dvije kohorte te sugerirali da je patern „kritični parametar“ za interpretaciju pozitivnih ANA IIF rezultata Arthritis Rheum 2011;61:191-200). Nuklearni fino zrnati patern bio je zastupljen samo kod zdravih pojedinaca, a središnjeg titra od 1:640 iznosi skoro dvije-trećine. Na suprot tome, nuklearni grubi zrnati, homogeni i nuklearni centromerni patreni pronađeni su samo kod pacijenata sa SAB-om. Nuklearni fini zrnati patern bio je prisutan i kod zdravih i kod bolesnih, mada je ipak primjećen viši titar kod bolesnih a niži kod zdravih ispitanika.
“Prema našem svakodnevnom iskustvu možemo reći bi da ANA patern mogao imati značaja za interpretaciju pozitivnih ANA rezultata. Iznenađeni smo koliki klinički značaj bi mogao imati ovaj parametar,“ prema riječima starijeg autora, Prof.dr. Luis E. C. Andrade, šefa odjela za reumatologiju Federalnog Univerziteta, Săo Paulo, Brazil. “ Naši rezultati pokazuju da se pojedini ANA paterni, kao što su nuklerani homogeni i nuklearni grubo zrnati paterni, kroz kliničku i laboratorijsku istragu upućuju na razrješenje sistemske autoimine bolesti, pogotovo u domenu sistemskog lupusa eritematodesa . Čak i ako nisu pronađene nikakve abnormalnosti u početnom testitanju, bilo bi mudro pratiti takvog pacijenta neko vrijeme u slučaju da prolazi kroz početnu fazu bolesti.”
Dok su Andrade i sradnici nastavili sa daljim istraživanjem u pravcu provjeravanja reproduktivnosti svojih otkrića, on je sugerirao da bi laboratorije mogle implementirati ovaj pristup prepoznavanja paterna. “zaposleni u laboratorijama trebali bi znati prepoznati ANA paterne koji su klinički relevantni i one koji su prisutni kod pojedinaca koji najvjerovatnije nemaju autoimunu bolest,” komentirao je.
Fritzler, jedan od pratećih autora, složio se da bi “ova studija mogla biti uvodni podsticaj za razumjevanje uloge pojedinih autoantitijela u dijagnozi SAB-a.” Fritzler je ipak iz predostrožnosti predložio da bez obzira koliko su ova dostignuća obećavajuća izrši “ među-laboratorijska razmjena seruma i uspostavljanje validnog referntnog standarda za nuklerani fino zrnati IIF patern, što je iznimno potrebno prije nego se ove obzervacije mogu iskoristiti za upotrebu u širokoj kliničko-laboratoriskoj praksi.”
Tehnologijski, strandardizacijski napredak
Nedavno, neki proizvođaći krenuli su prema automatizaciji analitičke i preanalitičke komponente IIF ANA testiranja, uključivši upotrebu automatske analize fluorescentne slike da bi došli do stvarnog titra, sto bi pomoglo u eliminisanju procesa ručnog bojenja serija razblaženih seruma. Bar jedan sistem istovremeno očitava multiple slajdove i daje bazične negativne i pozitivne rezultate i prepoznaje paterne.
Prepoznavanje varijabilnost IIF-a i drugih vrsta testova na autoantitijela dovelo je, u ranim 1980-tim do formiranja Odbora za standardizaciju autoantitijela kod reumatskih i srodnih bolesti pod pokroviteljstvom Međunarodnog udruženja imunoloških društava (International Union of Immunological Societies- IUIS), Svjetske zdravstvene organizacije, Artritis fondacije i Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC). Proteklih desetljeća, odbor je nadgledao referentne serume za 16 antinuklearnih antitijela, koji su bili dostupni preko CDC-a da bi istražio razvoj dijagnostičkih kitova i u kliničkim laboratorijama i u framaceutskim kompanijama. Andrade, predsjednik odbora, indicirao je daje skoro završen standard za citrulinski peotid, te da je u procesu je uspostavljane standarda za antitijela na beta-2 glikoprotein 1.
Također i druga stremljnja ka standardizaciji su u toku. Na primjer, Europska standardizacija autoimuniteta osnovana je 2002 godine, sa ciljem poboljšanja dijagnostike kod hroničnih reumatskih oboljenja jačanjem saradnje između kliničkih i laboratorijskih znanstvenika odogornih sa autoimunu dijagnostiku.
Pomak na veći protok analiza
Iako su se nove tehnologije, direktni dokazi, standardizacijski uradci udružili da poboljšaju učinkovitost IIF i drugih tradicionalnih testova na temelju hemaglutacione reakcije i imunodifuzije, ove metode su u velikoj kompeticiji sa enzimskim imunoesejima (ELISA) i drugih metoda čvrstih faza poput kao multipleks (kuglica-baziranih) eseja.
Ove nove metode, koje su se razvile u posljednjih 15 godina, pokrivaju više od polovine testiranja u SAD, budući da mnoge laboratorije većih kapaciteta koriste ove testove, prema Dr. David Keren, medicinskog direktora Warde medicinskih laboratorija u Ann Arboru u Michiganu.
Ove metode nude neke prednosti u doba stezanja remena u zdravstvu. Automatizirano i brže nego IIF, one se izvode na platformama koje se mogu koristiti za obavljanje drugih ispitivanja, također su lakše za sticanje i održavanje stručnosti laboratorijskog osoblja.
Kvaliteta tih testova je poboljšana tijekom vremena, te anketa Koledža Američkih patologa pokazuje da su se i ELISA i Multiplex testovi pokazali dobrim u odnosu na IIF, prema Keren. Međutim i ovi testovi imaju svoje probleme i izazove.
“Eseji čvrste faze kao što su kuglice i ELISA uključuju relativno malo antigena u odnosu na netaknute HEP-2 stanica. Oni također ne daju informacije kao što su obrasci paterni i visina titra, koju reumatolozi smatraju korisnom kod praćenja svojih pacijenata “, objasnio je Keren. “Nadalje, proizvođači testova solidne faze koriste različite kombinacije antigena, pa čak i unutar jednog proizvođača, mora se uspoređivati jedan sa drugim lotom.”
Šta nadostaje?
Jedna analiza komercijalnih multipleks ANA screening seto tvrdila je da je u setu korišten niz od 6 do 15 antigenskih kombinacija. (Lupus 2005; 15:412-421). Ovisno o tome kako su sastavljeni, neki testovi čvrste faze sadrže, pored specifičnih antigena, i ekstrakt od HEP-2 stanica što omogućuje otkrivanje širi raspon antigena. Ovi testovi općenito imaju dobru izvedbu, ali ovisno o vrsti pacijentove SAB-i i vrsti autoantitijela koje on ili ona ima, testovi će biti bolji ili lošije. Na primjer, nedavnom analizom pacijenata oboljelih skleroderme utvrđenoje da samo 51% pozitivih koristeći multipleks test u odnosu na 91 posto koristeći IIF (Clin Rheumatol 2011 10.1007/s10067-011-1766-6 DOI). Iako je dobro slaganje između metoda u otkrivanju Sc170 i RNP i centromernih antitijela, multiplex testovi nisu zabilježene nekoliko autoantitijela koja su od značaja za sklerodermiju.
“Test radi dobro u svojim okvirima, a to je otkrivanje onih specifičnih antitijela koa su prisutna u testu. Problem je što za određene podskupine bolesnika, ona ima visoku lažno negativnu stopu “, objasnila je vodeća autorica studije, Dr. Victoria Shanmugam, profesor medicine na sveučilištu Georgetown u Washingtonu, DC. U slučaju scleroderme, jedano od propuštenih autoantitijela, RNA polimeraza III, povezano je s lošom prognozom bolesti, samim tim neosjetljivost nekih testova predstavlja razlog za zabrinutost. “Takvi bolesnici imaju visoki rizik od bubrežne krize i mogu naglo oboljeti, kod njih bolest može početi prvo s bubrežnom krizom bez drugih znakov sklerodermije poput zadebljanja kože. Dakle, liječnik hitne ili internist najvjerovatnije neće uzeti u obzir sklerodermu kao dijagnozu, jer je ANA test negativan. Ova situacija bi potencijalno mogla dovesti do toga da se pacijent ne tretira na odgovarajući način. “
IIF: Još uvijek zlatni standard
Za laboratorije koji koriste ELISA ili multipleks ANA testove umjesto IIF, postavlja se pitanje da li korist od bržeg protoka i uštede vremena lab. osoblja nadmašuje probleme osjetljivost i specifičnost. Odgovor je ne, prema Američkom Koledžu reumatologije, koji je u 2009 izašao sa izjavom da je unatoč dolaskom multipleksa i drugih čvrsto – faznih testova, IIF ostaje zlatni standard za testiranje ANA (vidi tabelu ispod). Ova Izjava je značila poziv za laboratorije koji koriste novije metode da obezbjede podatke za ordinirajuće ljekare koji pokazuju da je njihov test ima istu ili bolji osjetljivost i specifičnost u odnosu na IIF.
|
Preporuke za ANA testiranje Radna skupina kliničkih stručnjaka sazvana od strane Američkog Koledža za reumatologiju (ACR) ispitala je dokaze vezane za testiranje antinuklearnih antitijela (ANA) i izdala svoje preporuke koje su odobrene od strane ACR uprave u 2009.
|
Gdje ovo vodi laboratorij i kliničare? Dok su Shanmugam i drugi reumatolozi zabrinuti da bi lažno negativni rezultati dobiveni ELISA- om ili multipleksom mogli doveti do potencijalno opasne bolesti koja je pogrešno dijagnosticirana ili bar nije na vrijeme identifikovana, drugi naučnici još pesimističnije gledaju na lažno pozitivne IIF ANA vrijednosti. “ANA često se izvodi kao skrining test i na žalost, to je loš test s niskom osjetljivosću i specifičnošću za bolesti. Dakle, kada se koristi na taj način, mogu se dobiti dosta slabije ili granično pozitivnih rezultata, a pacijenti od reumatologa samo mogu saznati bolest nije prisutna “, rekao je Dr. Charles Spencer, odjeljak šef reumatologije Nationwide dječije bolnice i profesor kliničke pedijatrije na Medicinskom fakultetu, Columbus Univerziteta, Ohio . “Nizak -titar ANA vjerovatno košta zdravstvenog sustava 500 $ do 2000 $ svaki put kada se izvodi što je je neprimjereno.”
Neka antinuklearna antitijela se koriste kao dio dijagnostičkih kriterija za određene sistemske reumatske bolesti, dok se druga koriste za potporu dijagnoze nekih SAB (vidi tabelu ispod).
|
ANA-a u Dijagnosticiranju sistemskih antireumatskih bolesti Neka antinuklearna antitijela koriste kao dio dijagnostičkih kriterija za određene sistemske autoimune bolesti, dok se druga koriste za potporu dijagnozu nekih SAB. |
||
|
Antinuklearno antitijelo korišteno kao |
||
|
Oboljenje |
Kriterij za dijagnozu |
Podrška dijagnozi |
|
SLE |
ANA, anti-dsDNA, anti-SM |
|
|
BMVT |
anti-U1RNP (high titer) |
|
|
Sjögren Syndrome |
Anti-SS-A(Ro)/Anti-SS-B (La) |
|
|
Skleroderma |
Anti-centromere, anti-topo I |
|
|
PM/DM |
Anti-tRNA synthetases |
|
|
Sek.fosfolipidni.s. |
ANA, anti-dsDNA |
|
|
Juvenilni hronični artritis |
ANA |
|
|
Legenda : anti-dsDNA: anti-duplo uvijena DNA; anti-SM: anti-glatki mišić; BMVT: bolest mješanog vezivnog tkiva ; anti-U1RNP: anti-U1 ribonukleoprotein; anti-topo I: anti-topoizomeraza I; PM/DM: poli-dermatomiozitis; Sekundarni F.s.: Sekundarni antifosfolipidni sindrom. Izvor:Internacionalna Federacija Kliničke Hemije i Laboratorjiske medicinske smjernice za testiranje antnuklearnih antitijela |
||
Izazovi u testiranju
Iako su reumatolozi upoznati s prednostima i nedostacima različitih metoda za testiranje ANA, oni često nisu ti koji prvi traže testiranje. Dr. Donald Bloch, reumatolog i vandredni profesor medicine na Medinskom fakultetu na Harvardu, naglasio je da opće nespecifični simptomi poput koštano-mišićnih bolova i umora, simtomi koje SAB-i dijele sa raznim drugim bolestima, mogu zavarati interniste. “Liječnik je suočen sa pacijentima koji imaju nespecifične simptome. On ne može razmišljati toliko unaprijed i diferencijalna dijagnoza je u širokom rasponu od funkcionalne dijagnoze dovrlo teške bolesti. On je u potrazi za nagovještajem – da li njegov pacijent ima autoimunu bolest? “
Ovaj problem može biti još složeniji kada ordinirajući liječnik nije upoznat koji ANA test koji se izvodi u laboratoriji. Prema Shanmugamovoj, u početku, nakon što nekoliko laboratorija preorijentisalo na ELISA ili multipleks test, bilo je teško tražiti IIF, ali ova situacija jer do sada ispravljena. “Laboratorij treba da osigura da liječnici opšte prakse, urgentne medicine te internisti imaju dostupane imunofluorescentne testove, tako da ukoliko imaju kliničke sumnju na autoimunu bolest imaju priliku da zatraže IIF”, predložila je Shanmugamanova.
Po istoj logici, laboratoriji koji nude novije metode trebaju promjeniti način rada i educirati liječnike o tome kako koristiti testove . “Ponekad se kod ELISA testa za ANU, ako je test pozitivan, automatski rade i druga ispitivanja. Ovakava testiranja obično nisu ni potrebna “, rekao je Spencer. “Bilo bi dobro imati neki barijeru, tako da se svi dodatni testovi ne neručuju automatski, što bi u stvari bio mudar korak za ovu proceduru.”
Svakako da smjernice za ANA testiranje od strane Međunarodne federacije za kliničku kemiju i laboratorijsku medicinu sugeriraju na to da liječnici i laboratorijski stručnjaci možda žele da se dogovore o “praktičnim algoritama za ispitivanje naručivanja testova, o racionalnim sagledavanje preliminarnih rezultata screeninga, kao i o interpretaciji konačnih pozitivnih rezultata. “
Mnogi laboratoriji, Carey je dodao, rade ELIS-u ako je ljekar naručio ANA test bez specificiranja na IIF. Ako je ELISA pozitivana, laboratorija potvrđuje rezultat pomoću IIF-a i daje izvještaj i o titar i o paternu.
Ovaj pristup, u kombinaciji s interpretacijom nalaza, dobro je funkcionisao na Henry Ford Health System (zdravstveni sustav), rekao je on. “Smatram da je ovo vrlo korisno u ubjeđivanju mojih kliničara da ukoliko je ANA skrininga slabo pozitivan, i ako vide da ne postoje znakovi i simptomi za postavljanje dijagnoze sistemske autoimune bolesti, oni su vjerojatno u pravu. Takve slučajeve sam vidio u izvještajima u kojima kliničari objašnjavaju značaj slabo pozitivnog testa pacijentu.”
Kao se tehnologije i dokazi oko ANA testiranja i dalje razvijaju, laboratoriji trebaju nastaviti komunikaciju s liječnicima. Kao što je primijetio Bloch, “To je naša odgovornost da učimo kliničarie da ne strahuju od pozitivanog ANA nalaza”.
