Koagulacijski testovi

Kada se dogodi oštećenje malih krvnih sudova i kapilara, organizam reguliše gubitak krvi putem fiziološkog procesa hemostaze. In vivo, hemostaza ovisi od intereakcije između koagulacijske kaskade plazme, trombocita i endotela krvnog suda. U kliničkoj laboratoriji, in vitro analitički testovi mogu mjeriti samo prve dvje komponente ovog sistema. Dakle, laboratorijsko mjerenje koagulacije predstavlja samo približno hemostatski sistem organizma.

Kliničari često naručuju koagulacijske testove, kao što su protrombinsko vrijeme (PT), aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (aPTT) i trombinsko vrijeme (TT) da bi procijenili funkciju zgrušavanja krvi kod pacijenata. Ovi testovi mogu biti od pomoći u razrješavanju uzroka neobjašnjenog krvarenja, ali ne mogu pomoći u predviđanju krvarenja. U stvari ni jedan test ne može predvidjeti krvarenje u perioperativnom ili postoperativnom periodu. Ovi testovi su od male pomoći u predviđanju zgrušavanja krvi ili tromboze u odsustvu povrede krvnog suda. Dobro opisane analize su dostupne za testiranje nasljedne sklonosti za trombozu, ali većina trombofilijskih stanja ne mogu se kvantificirati ni jednim trenutno dostupnim laboratorijskim testom.

Laboratorijska procjena hemostaze predstavlja izazov za laboratorijske radnike i kliničare koji interpretiraju rezultate. Ovaj članak kratko objašnjava česte testove koji se koriste za procjenu hemotaze, kao i njihov klinički smisao i daje smjernice kliničkim hemičarima za pocjenu neobjašnjenih krvarenja.

Abeceda koagulacijskih testova

Laboratorijski testovi za hemostazu tipično zahtjevaju citriranu plazmu dobijenu iz pune krvi. Uzorak treba uzeti u epruvete koje sadrže 3,2% natrijum citrata (109mM) u odnosu 9 dijelova krvi i 1 dio antikoagulanta. Svrha citrata je da ukloni kalcijumove jone koji su esencijalni za koagulaciju krvi; međutim, neadekvatno napunjena epruveta uzrokuje da konačna koncentracija citrata u uzorku bude previsoka. Ovo je važno jer PT i aPTT testovi zahtjevaju dodatak kalcijuma. Ako uzorak sadrži višak citrata, dodatak kalcijuma može biti nedovoljan i nizak plazmatski kalcijum će voditi do vještačkog produženja protrombinskog vremena – PT ili aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena – aPTT.

Sličan ali suptilniji problem može nastati ako je hematokrit pacijenta neobično visok, tipično ≥55%. Normalno, 10mL krvi sa hematokritom od 40% sadrži 6mL plazme. Ako je hematokrit abnormalno povišen, npr. 65%, uzorak će sadržavati samo 3,5 mL plazme dovodeći do njenog prekomjernog citriranja.

Za PT test, dodavanje tromboplastinskog reagensa koji sadrži tkivni faktor, kalcijum i fosfolipide inicira koagulaciju zagrijanog uzorka preko vanjskog puta koagulacije (Slika 1). Slično, aPTT test se započinje dodavanjem u plazmu negativno nabijenih površina kao što je silicij kao i fosfolipidni ekstrakt kojem je oduzet tkivni faktor. Koagulacijski put u aPTT testu predstavlja unutrašnji koagulacijski put (Slika 1).

Slika 1. Koagulacijska kaskada. Koagulacijska kaskada je serija enzimskih reakcija koje prevode inaktivne prekursore u aktivne faktore. Krajnji rezultat kaskade je produkcija fibrina, proteina koji vezuje trombocite i ostale materijale u stabilni ugrušak. Kaskada ima dva puta: vanjski (posredovan tkivnim faktorom) i unutrašnji (iniciran sistemom kontakta). Ova dva puta se udružuju i postaju zajednički put sa aktivacijom faktora X. Pokazani su koraci u kaskadi koji se mjere sa tri česta koagulacijksa testa: PT, aPTT i TT.

 

Kada pacijent ima abnormalno produžene PT i aPTT, laboratorije trebaju obaviti test miješanja uzorka (Tabela 1). Da bi proveo test laborant miješa iste količine citrirane plazme pacijenta sa normalnom plazmom i ponovi PT i aPTT testove. Ako je vrijeme zgrušavanja sada unutar PT ili aPTT referentnim intervalima, prvobitni abnormalni rezultat je posljedica nedostatka jednog ili više faktora zgrušavanja. Suprotno, prisustvo inhibitora u plazmi pacijenta ometa faktore koagulacije u normalnoj plazmi, ali miješanjem rezultata studije neće dati normalno vrijeme zgrušavanja. Drugi čest test koji se koristi za procjenu hemostaze je TT (Slika 1). Ovaj test mjeri sposobnost fibrinogena da formira fibrinske niti in vitro. Da bi se test uradio, laborant dodaje egzogeni trombin u zagrijanu plazmu. Ovaj korak osigurava da je rezultat neovisan o endogenom trombinu ili bilo kojem drugom faktoru koagulacije. TT je posebno senzitivan na heparin.

 

Kvantitativni fibrinogenski test je modificirani TT test. Ovaj test zahtjeva dodatak egzogenog trombina, samo što u ovom slučaju plazma se razrjeđuje nekoliko puta i dodaju se veće količine trombina u poređenju sa TT testom. Rezultati koji su izraženi u mg/dL umjesto u sekundama utvrđeni su iz standardne krivulje koja je generirana iz plazme koja služi kao kalibrator.

Drugi test koji je često u upotrebi za procjenu hemostatske funkcije je D-dimer. Ovaj degradacijski produkt zrelog umreženog fibrina nastaje akcijom enzima plazmina na fibrin, a povišeni nivo je indikator tromboze. Dva tipa laboratorijskih testova mjere D-dimer: nekompetetivni, sendvič imunoesej i imunoturbidimetrijski testovi. Određivanje D-dimera se koristi zbog njegove visoke negativne prediktivne vrijednosti za trombozu. Kada je koncentracija u svojim referentnim vrijednostima, kliničari mogu isključiti suspektnu duboku vensku trombozu (ili plućnu emboliju). Pacijenti koji su doživjeli traumu, operaciju ili trudnice često imaju povišene vrijednosti D-dimera.

Test za aktivirano vrijeme zgrušavanja (ACT) koristi punu krv koja se miješa sa aktivatorom ugruška obično diatomaceoznom zemljom ili kaolinom. Zgrušavanje traje 70-180 sekundi i može se mjeriti mehanički ili elektrohemijskom procedurom. Bolnice koriste test uz krevet pacijentada bi se nadgledaotretman visokom dozom heparina tokom operacije postavljanja kardiopulmonalnog bajpasa kao i tokom kardijalne kateterizacije.

Test aktivnosti faktora zgrušavanja krvi određuje razinu različitih faktora koagulacije. Esencijalna komponenta testa je faktor-deficijentna plazma, kojoj nedostaje određeni faktor koji se ispituje. Za izvođenje testa, tehnolog razrjeđuje citriranu plazmu pacijenta u puferu i miješa razrijeđene uzorake jedan-prema-jedan s faktor-deficijentnom plazmom. Pacijentova plazma obezbjeđuje faktor koji nedostaje, a test se završava izvođenjem standardnog PT ili aPTT, ovisno koji se faktor testira. Kao primjer za faktore VIII i IX, koji sudjeluju u unutarnjem putu koagulacije, laboratorija treba uraditi aPTT. Nasuprot tome, PT test će se koristiti za određivanje faktora VII, koja je uključen u vanjski put koagulacije. Kalibracija testova uključuje standardnu referentnu plazmu sa poznatim koncentracijama faktora koji se ispituje.

Funkcija trombocita

Druga komponenta laboratorijske procjene hemostaze je testiranje funkcije trombocita. Agregacija trombocita smatra se klasičnim testom funkcije trombocita. Ovaj test uključuje agonist aktivacije trombocita – ADP, epinefrin ili kolagen. Laborant dodaje agonist u plazmu bogatu trombocitima i nadgleda agregaciju trombocita u kiveti fotometra. Promjene optičke gustoće se bilježe agregacijskom krivuljom.

Ostali uređaju mjere adheziju trombocita pod uvijetima visokog pritiska. U ovom metodu, instrument prvo uzima dio uzorka kroz kapilaru pod uvijetima visokog pritiska, a onda kroz veoma mali otvor na jednokratnom spremniku. Spremnik je pokriven kolagenom i epinefrinom ili kolagenom i ADP. Kod normalnih osoba ovo proizvodi adheziju trombocita i aktivaciju koja zatvara otvor i zaustavlja protok. Krajnja tačka testa zove se vrijeme zatvaranja.

Anti-Xa test

Kliničari povremeno rade anti-Xa test da bi nadgledali i prilagodili nivoe pacijentovog nefrakcioniranog heparina. Ova hromogena metoda generalno sadrži egzogeni faktor Xa i antitrombin (AT), oba u višku kao i hromogeni supstrat za faktor Xa. Neke verzije testa koriste umjesto egzogenog, pacijentov AT, inhibitor serin protease koja je glavni inhibitor koagulacijske protease. U bilo kojem pristupu, heparin prisutan u uzorku gradi kompleks sa AT i ovaj kompleks inhibira faktor Xa. Eventualni ostatak faktora Xa cijepa hromogeni supstrat, oslobađajući žuto obojeni hromofor. Rezultati se izražavaju kao anti Xa aktivnost u jedinicama po mL (U/mL).

Klinički problemi udruženi sa krvarenjem

Mnoga klinička stanja mogu viditi ka neobjašnjenom krvarenju. Odgovarajuće testiranje može pomoći kliničarima da prepoznaju uzrok. U Tabeli 2. su prikazani najčešći uzroci i koji testovi bi se trebali koristiti.

 

Urođena hemofilija

Ovaj klasični poremećaj krvarenja je X-vezana recesivna genetska abnormalnost. Muškarci sa jednom kopijom defektnog gena oboljevaju, a žene su asimptomatski nosioci oboljenja. Bolest potiče od jednog ili dva izmjenjena proteina u kaskadi koagulacije, faktor VIII (hemofilija A) ili faktor IX (hemofilija B) koji se klinički ne mogu razlikovati. Incidenca hemofilije A je 1 na 5000 muškaraca, a hemofilije B 1 na 30,000.

Pacijenti sa hemofilijom imaju smanjenu aktivnost faktora VIII ili IX u svježoj, citriranoj plazmi i bolest je klasificirana kao teška (<1%), umjerena (1–5%), ili blaga(6–30%) ovisno o aktivnosti faktora. U teškim oblicima pacijenti imaju spontana, duboka krvarenja u mišićima i zglobovima kao i teška krvarenja nakon povrede. Bolest se prezentira u u djetinjstvu. Blaga forma može se prezentirati u odrasloj dobi ili čak kasnije,u srednjim godinama. Pacijenti krvare nakon operacija ili povreda, ali ne spontano.

Sljedeći laboratorijski rezultati su u skladu sa nalazima za hemofiliju: 1. Značajno produžen aPTT koji se korigira u 1:1 testu miješanja; 2. PT je referentan; 3. Fibrinogen i TT su referentni; 4. Normalna funkcija trombocita; i 5. Normalni rezultati testa na von Willebrand (vidjeti niže).

von Willebrand-ova bolest

Defektna sinteza ili otpuštanje funkcionalnog von Willebrandovog faktora uzrokuje defektnu adheziju trombocita i vodi ka različitim stanjima kao što su: epistaksa, teško menstrualno krvarenje i lako stvaranje modrica.

Laboratoriji koriste imunoturbidimetrijsku tehniku za mjerenje plazmatske koncentracije vWF i aktivnosti vWF koristeći plazmu pacijenta u kombinaciji formalin fiksiranim trombocitima i ristocetinom koji služi kao kofaktor u testu. Drugi test ispituje strukturu vWF multimera. Pomoćni test je aktivnost faktora VIII, obzirom da je nizak vWF često udružen sa niskom aktivnošću faktora VIII. Ako je aktivnost faktora VIII dovoljno smanjena, aPTT može biti produžen. U većini oblika von Willebrandove bolesti, krvarenje je posljedica disfunkcije trombocita koja je rezultat nedovoljne aktivnosti vWF a ne zbog smanjene aktivnosti faktora VIII.

Stečena hemofilija

Iako rijetka, stečena hemofilija je rezultat spontanog nastanka autoantitijela protiv faktora VIII kod predhodno zdrave osobe, muškarca ili žene. Kako i samo ime kaže, nema genetske komponente. Aktivnost faktora VIII je značajno smanjena kao rezultat autoantitijela i dovodi do teških i nekontrolisanih krvarenja.

Laboratorijske studije pokazuju značajno produžen aPTT, normalan PT i smanjenu aktivnost faktora VIII. Kod ovih pacijenata 1:1 test miješanja ne koriguje abnormalni aPTT.

Stečeni von Willebrand Sindrom (AVWS)

Rijedak sindrom koji se odnosi na razvoj von Willebrandove deficijencije relativno kasno u životu kod predhodno zdrave osobe. Ovaj sindrom se može se vidjeti u različitim limfoproliferativnim poremećajima, poremećajima monoklonalnih plazma ćelija, autoimunim bolestima, bolesti srčanih zalistaka, septalnog defekta. vWF aktivnost može se reducirati sa inhibitornim antitijelima, adsorpcijom na stanice ili površine sa povišenim pritiskom koji se javlja kod stenoze srčanih zalistaka ili septalnog defekta.

Laboratorijske studije pokazuju smanjenu aktivnost faktora VIII, produženo aPTT ako je faktor VIII <40%, poremećen odgovor trombocita na ristocetin i produženo vrijeme krvarenja.

Niti jedan od standardnih laboratorijskih testova opisan gore ne daje informaciju za identifikaciju trobofiličnih stanja. U najvećem broju slučajeva hiperkoagulabilni poremećaji su stečeni i osim za antifosfolipidni sindrom i nasljedne trobofilije nema informativnih laboratorijskih testova. (Tabela 3).

 

Antifosfolipidni sindrom (APLS)

Autoimuno protrombotsko stečeno stanje, često je povezano sa značajno produženim aPTT, što zabrinjava jer aficirana osoba može biti pod rizikom od velike hemoragije. Tipično je povezan sa venskim tromboembolizmom i/ili arterijskom trombozom. Stanje može dovesti do gubitka fetusa ili mrtvorođenčetom što vjerovatno nastaje kao rezultat upale posteljice ili tromboze.

Ove osobe imaju antitijela poznata kao lupus antikoagulanti (LA). Ova antitijela su protiv kompleksa beta-2-glikoproteina I/fosfolipid ili protrombin/fosfolipid i ona ometaju i produžavaju testove zgrušavanja in vitro. U vaskularnom sistemu organizma, prisustvo endotelnih stanica i leukocita kao i mnogih drugim komponenti koje su odsutne u pojednostavljenom testu zgrušavanja in vitro, povećavaju vjerovatnost zgrušavanja.

Klasični laboratorijski nalaz kod APLS-a je produžen aPTT, normalan PT i bez korekcije aPTT-a u 1:1 testu miješanja. Dodatak viška fosfolipida u aPTT testu smanjuje vrijeme zgrušavanja. Ovo je osnova LA testa. Jedna verzija LA testa je vrijeme razrjeđenja Russell zmijskog otrova (dRVVT). Komponente testa aktiviraju samo zajednički koagulacijski put putem faktora X i oni su neovisni od faktora VIII ili antitijela na faktor VIII. Laboratorije takođe mogu potvrditi antifosfolipidni sindrom detekcijom IgG ili IgM antitijela na kardiolipin ili na beta-2-glikoprotein i pomoću ELISA testa.

Faktor V Leiden

Varijanta faktora V, faktor V Leiden uzrokuje urođenu hiperkoagulabilnost. Osobe sa ovim poremećajem imaju mutaciju na genu faktora V koji dovodi do zamjene aminokiseline (arginin u glutamine, R506Q) što čini preotein rezistentnim na inaktivaciju sa aktivnim proteinom C. Heterozigotnost za faktor V Leiden povećava rizik od venskog tromboembolizma oko 2-3 puta.

Laboratorijski rezultati za ovo genetsko stanje su: PT i aPTT u normalnom rasponu. Dodatno, aPTT će biti rezistentan na aktivirani protein C i kod normalnih osoba dodavanje aktiviranog protein C svježoj plazmi uzrokovat će produženje aPTT. Ovaj efekat izostaje kod osoba sa faktorom V Leiden. DNA testovi definitivno potvrđuju zamjenu nukleotida G1691A.

Protrombin G20210A

Urođena trombofilija, G20210A polimorfizam u protrombinskom genu povećava plazmatsku koncentraciju protrombina (FII) bez mjenjanja aminokiselinske sekvence proteina.

Pacijenti sa ovom mutacijom imaju PT i aPTT unutar normalnih vrijednosti. DNA studije će pokazati G-za-A supstituciju na 3’- netranslatiranoj regiji protrombinskog gena na nukleotidu 20210.

Deficijencija proteina C i S

Ova dva faktora ovisna o vitaminu K prekidaju aktivnost faktora zgrušavanja V i VIII. Aktivirani protein C je preoteolitički enzim, dok je protein S esencijalni kofaktor.

Deficijencija antitrombina (AT)

AT, prije nazivan i AT III, je vitamin K neovisni glikoprotein koji je glavni inhibitor trombina i drugih koagulacijskih serin proteaza uključujući faktore Xa i IXa. Antitrombin formira kompetitivni 1:1 kompleks sa svojim ciljem, ali samo u prisustvu negativno nabijenih glikozaminoglikana kao što su heparin ili heparin sulfat.

Pacijenti sa AT deficijencijom će imati malo ili nikako AT III aktivnosti mjerene u hromogenom testu.

Interpretacija koagulacijskih testova

Kao is a svim laboratorijskim testovima, cilj laboranata je da pomažu kliničarima sa upotrebom i interpretacijom testova za procjenu hemostaze. Za razliku od povišenog serumskog kreatinina ili povišenog tireo-stimulirajućeg hormona koji indicira smanjenu renalnu funkciju i hipotireoidizam, testovi za hemostazu moraju biti interpretirani sa kliničom slikom i drugim laboratorijskim nalazima. Obzirom na strašne posljedice neobjašnjenog krvarenja, klinički laboranti bi trebali aktivno savjetovati kliničare o upotrebi i interpretaciji koagulacijskih testova. Naasumični pristup poremećajima hemostaze je rijetko uspješan i može rezultirati odgođenom dijagnozom i liječejem pacijenata.

 

PREPORUČENA LITERATURA

Eby CS. Warfarin Dosing. Should Labs Offer Pharmacogenetic Testing? CLN 2009;35(6).

Harris NS, Winter WE. The International Normalized Ratio A Tool for Monitoring Warfarin Therapy. CLN 2010;36(11).

Harris NS, Winter WE, Ledford-Kraemer MR. Hemostasis: A Review & Methods of Assessment in the Clinical Laboratory. Chapter 21, pp 265-283. IN: Contemporary Practice in Clinical Chemistry 2nd Edition, Clarke, W. 2011 (AACC Press, Washington DC).

Hoffbrand AV, Moss PAH. Essential Haematology. 6th Edition. Chapters 26 (Coagulation Disorders) and 27 (Thrombosis and Antithrombotic Therapy). Wiley-Blackwell 2011.

Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: A modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin N Am 2007;21:1–11.

Kroll MH. ThromboelastographyTheory and Practice in Measuring Hemostasis. CLN 2010;36(12).